质粒提取工作，涉及从学生到科学家、从实验室到工厂、从基础研究到产业转化的几乎

　　无论你是刚进实验室的研究生，还是在GMP车间里工作的工艺工程师，只要你在做分子层面的工作，就绕不开这个“看似简单但极其关键”的实验。

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　　复制起始位点：Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分 子有多个复制起始位点。

　　（4）Neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（卡那霉素衍生物）失活

　　第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。

　　第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

　　第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体，克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用哪种载体，还是要以实验目的为标准。

　　启动子-促进DNA转录的DNA顺序，这个 DNA 区域通常在基因或操纵子编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

　　增强子/沉默子-为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作用与增强子所在的位置或方向无关，即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子，负调控序列。

　　核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG （起始密码）和 SD 序列。

　　转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富集区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。

　　或基础研究，我们遵循“表达有差异，差异影响表型”的原则。主要符合以上两条，文章就已经成型了。分子机制的探究，是升华。然而，纯生信已经很难，甚至无法发表论文了。因此，我们一定要掌握差异表达相关的实验操作。在研究基因功能时，无论是过表达，还是基因敲除，我们都一定要通过PCR构建载体，然后转导到大肠杆菌；摇菌扩增后，提取细菌的质粒，从而用于后续细胞实验。

　　溶液Ⅰ：Lysozyme可以溶解细胞壁，主要是针对一些细胞壁比较厚的细菌。日常提取质粒的试剂盒似乎在溶液Ⅰ中没有添加Lysozyme。EDTA或者CDTA是金属离子螯合剂，能够螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，细胞壁外层是脂多糖LPS，携带负电荷。要维系LPS的稳定性，必须要有足够多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+，就会使LPS解体，暴露出内层的肽聚糖，因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是细胞膜的重要成分，对于细胞内很多酶的活性至关重要。同时，EDTA可以破坏细胞膜，抑制细胞内许多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解。Glucose可以给细胞一个osmotic shock (渗透压)，导致细胞壁和细胞膜裂解；还有一种说法，Glucose能增加溶液的黏稠度。使细胞不至于快速沉降。

　　溶液Ⅱ：SDS能够破坏细胞壁，使细胞内容物 (Lysate)释放，还可以使蛋白变性，结合到蛋白表面。在这样的一个过程中，chromosomal DNA会被降解成线性片段，一旦遇到强碱（12.0-12.5），chromosomal DNA会发生变性分离变成单链，但是plasmid DNA对此PH范围耐受，仍然以双链形式存在。

　　溶液Ⅲ：醋酸钠可以中和强碱，chromosomal DNA发生复性，但是没办法恢复原来天然的双链结构，而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心，SDS-protein-chromosomal DNA复合物，其他的细胞裂解物全部沉淀管底，只有plasmid DNA溶解在上清中。

　　在基因工程中，质粒可作为一种理想的基因载体，携带外源基因进入宿主细胞，还可以实现外源基因的稳定复制和表达。例如，若需要大肠杆菌生产人类的胰岛素，就可以将胰岛素基因插入到质粒中，再把质粒导入大肠杆菌，这样大肠杆菌就能按照质粒上的信息生产胰岛素了。质粒是基因工程的强有力的工具，能运载目的基因，实现基因的转移与表达，是构建重组DNA分子的关键一环。我们在基因结构和研究过程中需要大量纯的质粒，有效的质粒提取方法对实验的准确性和稳定能力有重要的作用。

　　质粒提取即去除RNA，基于质粒DNA与其他细胞成分在结构、理化性质上的差异，将质粒和细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。质粒提取的主要步骤包括：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取从具体操作方法大致上可以分为：碱裂解法、煮沸裂解法和硅胶膜吸附法。从提取产量上分为：小提、中提和大提。

　　这是实验室最常用的质粒提取方法，堪称经典中的经典。其原理是基于质粒DNA与细菌基因组DNA在结构和性质上的差异。在碱性条件下，细菌细胞壁被裂解，双链DNA氢键断裂解链，而质粒DNA因其超螺旋结构，即便变性也能紧密缠绕。加入酸性中和液后，质粒DNA因为分子量小能够迅速复性，而细菌基因组DNA和蛋白质、细胞碎片等杂质由于分子量巨大则会形成沉淀。通过离心，可将上清液中的质粒DNA与沉淀分离，再经乙醇沉淀等纯化步骤，可得到纯净质粒。

　　它是利用高温（100℃左右）将细菌悬浮液快速加热至沸点，使细菌细胞快速裂解，同时细胞内的蛋白质成分变性。在这样的一个过程中，细菌染色体DNA断裂成线性片段，而质粒DNA因共价闭合环状结构稳定保持完整结构。通过离心的方式去除沉淀在底部的细胞碎片和变性蛋白，收集上清液中的质粒DNA，以此来实现快速分离。

　　随着技术的发展，硅胶膜吸附法在实验室受到广泛的应用。它基于硅胶膜在高盐低pH值条件下，能够与带负电荷的核酸（包括质粒DNA）通过静电作用和氢键等相互作用特异性地结合的原理。当含有质粒DNA的裂解液通过硅胶膜离心柱时，质粒DNA会紧紧吸附在硅胶膜上，而蛋白质、多糖等其他杂质则被洗脱下来。然后，再用低盐高pH值的洗脱缓冲液，破坏硅胶膜与质粒DNA的结合力，就能将纯净的质粒DNA从硅胶膜上洗脱下来，进而达到提取和纯化质粒DNA的目的。

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　　选择正真适合菌株和培养基：根据质粒特性选相应宿主菌株，用含合适抗生素的培养基，如大肠杆菌常用LB培养基，确保质粒稳定存在。

　　控制培养条件：注意摇床转速、培养温度、培养时间等，一般大肠杆菌37℃、200～250rpm培养12-16小时，避免过度培养致质粒丢失或降解。

　　温和裂解细胞：用合适的裂解液，如碱裂解法的溶液I、II、III，加溶液II后避免剧烈振荡，防止基因组DNA断裂与质粒混合。

　　控制裂解时间和温度：加溶液II后裂解时间一般5-10分钟，过长会使质粒变性难以复性。裂解温度一般在室温或冰上进行，避免温度过高加剧蛋白质和核酸变性。

　　去除蛋白质和杂质：选择正真适合的抽提试剂，可加酚-氯仿等有机溶剂抽提，离心后取含质粒的上清，操作轻缓，防止DNA断裂。

　　沉淀质粒：选择合适的沉淀剂，用乙醇或异丙醇沉淀，加适量盐离子促进沉淀，低温放置一段时间可提高沉淀效率，离心后弃上清时小心操作，避免丢失质粒沉淀。

　　洗涤质粒：用70%乙醇洗涤沉淀，去除残留盐离子等杂质，洗涤后充分晾干，一般在室温下晾干或在超净工作台中风干5分钟左右，但不能过度干燥致质粒难以溶解。

　　使用无核酸酶的耗材和试剂：枪头、离心管等耗材要无核酸酶，水和缓冲液等试剂也要确保无核酸酶污染，必要时可高温灭菌或用DEPC处理。

　　防止DNA酶降解：操作在冰上或低温进行，抑制DNA酶活性，也可加DNA酶抑制剂。

　　检测与保存：抽提后用电泳检测质粒完整性和纯度，短期可-20℃保存，长期宜-80℃保存。

　　细菌质粒是一类双链、闭环 DNA，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下 也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

　　纯化质粒 DNA 的方法通常是利用了质粒 DNA 比较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这一些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒 DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒 DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

　　然而，较长的载体(如 pBR322)由于不能如此自由地复制，所以要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干 小时，以便对质粒进行扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像 pBR322-类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素(μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

　　2) 可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入 EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或 碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件回到正常状态时，质粒 DNA 链迅速得到复性，重新形成完全天然的超螺旋分子。

　　3) 一些大肠杆菌菌株(如 HB101 的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯 化铯-溴化乙锭梯度离心进行质粒纯化时会出现麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 DNA 所占位置形成 一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

　　５) 目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些科研工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒 DNA 的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素能够尽可能的防止这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒 DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。

　　11. 1% 琼脂糖凝胶：称取 1 g 琼脂糖于三角烧瓶中，加 100 ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至 60 ℃左右，加 EB 母液（10 mg/ml）至终浓度 0.5 μg/ml（注意：EB 为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓 倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却 30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液 0.5 ×TBE），即可上样。

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　　1、菌液较多：能够最终靠几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低，菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解，导致导致提取量和纯度偏低。质粒提取使用的溶液I主要是悬浮菌体，溶液II裂解菌体，其中的高浓度NaOH破会细菌细胞壁和细胞膜，使菌体中的质粒DNA释放开来，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢复中性环境，利于质粒DNA复性，溶液II中SDS的Na+会被K+置换，SDS变为PDS并结合大分子的基因组DNA,蛋白质和细胞碎片形成不溶物，然后通过离心能够获得含有质粒DNA的上清。因此加入溶液II后要温和地混合，不要剧烈震荡，以免使基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，若接着来进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀，无法通过离心分离得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液没有变清亮后可以适当按比例加大溶液Ⅱ和后续溶液Ⅲ的用量。

　　2、菌液培养时间：使用TB培养基培养菌液的时间一般在16小时左右，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，导致活菌比例降低，进而基因组DNA污染概率增大。培养时间应优选的控制在12-16 h内。

　　3、宿主菌株：宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放开来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。

　　4、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体，或者加大提取的菌液量，并减小洗脱时的体积。当所提取的质粒大于10 kb时，由于菌体承载力有限，大质粒复制效率往往会低于普通质粒，因此推荐增大菌液量以获得更好的提取产量。

　　5、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况，导致没办法提出质粒，若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

　　6、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加裂解液的用量。并确保细菌混悬均匀。菌体沉淀未能充分悬浮或悬浮后有较多气泡也会导致裂解不充分，要注意让菌体充分悬浮并将较多的气泡用移液器吸出。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用试剂盒溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

　　7、溶液不正确使用：溶液II在温度较低时也许会出现浑浊，可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液，方可使用。

　　8、吸附柱过载：不一样的产品中吸附柱吸附能力不同，若需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具备极高的生长率，则需减少LB培养液体积。

　　9、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

　　10、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，可置于室温静置20-30分钟，或放到超净台上风吹15分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

　　11、盐离子污染：当漂洗操作不当或漂洗不充分时将导致盐离子污染，该指标可通过OD260/230比值鉴定，通常大于2.0是可接受的。在使用试剂盒时应确保Wash Buffer的漂洗次数和漂洗液加入量。

　　12、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位，可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。

　　13、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能会引起洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。为追求高浓度质粒而减小洗脱液体积将会导致洗脱不充分进而降低产量，因此要确保洗脱液的用量，此外Elution Buffer预热至60℃和重复洗脱将更加有助于洗脱效率提升。

　　14、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

　　15、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时在说明书的建议时间基础上适当延长静置或者洗脱两次可达到较好的效果。

　　16、菌液培养时间多久合适?细菌培养时间建议别超过16小时，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，都会影响收集的菌体量，进而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前，可以将保存的菌种先进行活化，然后再接菌，可使过夜培养的菌液生长更充分，在一些范围内菌体量的增加，能大大的提升所提质粒的浓度。

　　17、质粒提取试剂种类这么多，如何抉择适合的呢？根据提取菌液量的大小，质粒提取试剂盒可分为质粒小提（1-5mL）、质粒小提中量（5-15mL）、质粒中大提（15-50mL）和质粒大提（50-300mL）四类；同时每一类中还可根据要不要去除内毒素来进一步划分。研究者可根据不同的实验需求，来选择相应的试剂盒，通常来说，对于常规的载体构建实验、测序需求，一般试剂盒都能达到一定的要求；若后续做细胞转染实验则需选择去内毒素的质粒提取试剂盒。如不知道选择何种试剂品牌，则可以优先选择在提取试剂领域专业深耕，有产品口碑又有产品性能的品牌，如Qiagen、BIOG等。

　　18、质粒转染后细胞出现死亡或转染效果差，从质粒本身分析，原因可能有哪些？如果下游转染出现以上问题，从质粒本身来看，可能是因为：

　　· 未使用去内毒素的质粒提取试剂盒。内毒素可与质粒DNA竞争转染试剂，阻碍质粒DNA进入细胞，从而极大程度地影响转染效率；同时，由于转染试剂会使细胞膜的通透性增加，内毒素进入细胞，导致细胞活力降低甚至引起死亡，则会促进影响转染效率。建议选用添加有高效含内毒素清除因子的质粒提取试剂，以高效清除提取质粒中残存的内毒素。鲎试剂测试表明，使用BIOG EndotoxinOUT 提取得到的质粒溶液，内毒素去除率可高达90%以上，可大幅度的提高细胞转染的效率。

　　· 质粒纯度不够。在常规质粒提取试剂中，碱裂解法最为常用，但要注意其操作的流程中，动作必须尽量温和，否则基因组DNA会由于剧烈操作而被破坏成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收，不仅会导致分光光度计测定的质粒DNA浓度值虚高、影响质粒提取的纯度，还会影响后续的转染效率。因此，质粒提取后进行琼脂糖凝胶电泳就显得很有必要，可检测质粒中是否含有残留的基因组DNA或RNA，便于研究者对质粒质量有更好的把控。

　　· 菌种活性不佳：如菌种保存时间过久，质粒可能丢失，建议培养前先划线活化，以稳定产量；如大肠杆菌太陈旧（低温下长期保存的菌等），建议重新涂板培养后挑选新菌落进行液体培养；

　　· 质粒本身拷贝数低。载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液产量为3-16μg）；长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5-2μg；低拷贝质粒能增加起始菌液量来提高浓度；

　　· 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

　　20、菌液较多：能够最终靠多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中（收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率）。未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低，菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解，导致导致提取量和纯度偏低。

　　加入溶液II后要温和混合，不要剧烈震荡，以免使基因组DNA断裂污染质粒；时间不应超过5min。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，若接着来进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀，无法通过离心分离得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液没有变清亮后可以适当按比例加大溶液Ⅱ和后续溶液Ⅲ的用量。

　　21、菌液培养时间：使用TB培养基培养菌液的时间一般在17小时左右，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，都会影响收集的菌体量，进而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前，可以将保存的菌种先进行活化，然后再接菌，可使过夜培养的菌液生长更充分，在一些范围内菌体量的增加，能大大的提升所提质粒的浓度。

　　22、宿主菌株：宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放开来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，建议将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中进行质粒纯化。

　　23、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体，或者加大提取的菌液量，并减小洗脱时的体积。

　　24、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况，导致没办法提出质粒，若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

　　25、溶液不正确使用：溶液II在温度较低时也许会出现浑浊，可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液，方可使用。

　　1.柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。

　　注意：菌液较多时能够最终靠几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。

　　3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是不是已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

　　注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

　　4.向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

　　注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

　　5.向离心管中加入500μl溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，12,000rpm(~13,400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

　　注意：P4加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

　　6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心2min，滤液收集在干净的2ml离心管中（自备）。

　　7.向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多轻易造成RNA污染），上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。

　　注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP4的最大容积为700μl，所以要分次过柱。

　　8.室温12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

　　9.向吸附柱CP4中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

　　10.向吸附柱CP4中加入600μl漂洗液PW（请先检查是不是已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

　　注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5min，有助于更好地去除杂质。

　　12.将吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

　　注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

　　注意：为增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤12。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应该少于100μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

　　电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。

　　OD260/OD280比值应为1.7–1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

　　在质粒提取实验中，有很多小伙伴会遇到有溶液不够用的情况，尤其是在使用试剂盒的情况下。

　　作用：葡萄糖用于增加溶液粘度维持渗透压，防止DNA受机械切力降解；而EDTA则螯合金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用，并有利于溶菌酶的作用。

　　替代品：能够正常的使用其他能够给大家提供类似碱性环境的溶液，例如新鲜制备的0.2-0.4M NaOH与1%-2%SDS替代。

　　作用：中和碱，沉淀杂质和蛋白质并通过沉淀物将大片段基因组去除，同时让质粒DNA复性。

　　替代品：可优先考虑使用其他pH缓冲液，如醋酸钠（NaAc）与醋酸混合制成的缓冲液，调整至接近pH 4.8以模拟中和液的效果。

　　主要成分：Tris-HCl（pH 8.0）和EDTA（根据下游实验需求，EDTA可选择是否含有）

　　替代品：可以自制相同成分和浓度的溶液或者PH为7.5-8.0的灭菌水作为代替。

　　通过合理选择和操作，即使在非标准条件下也能有效地完成质粒提取实验。但要记住，替代方案虽好，但使用前一定要确保浓度和pH值准确，以免影响实验结果。

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